6 Определение количества клеток микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (метод Коха)

6 Определение количества клеток микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (метод Коха).

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объёма исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ).

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений; посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

1. Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде, жидкой питательной среде или в 0,85%-м растворе NaCl (физиологическом растворе). Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 см 3 в стерильные сухие пробирки. Затем 1 см 3 исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см 3 стерильной воды – это первое разведение (10 -1 ). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную суспензию клеток. Затем той же пипеткой отбирают 1 см 3 суспензии и переносят во вторую пробирку, получая второе разведение (10 -2 ). Таким же образом готовят последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата вследствие высокой способности клеток микроорганизмов к сорбции на поверхности стекла.

2. Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 – 20 см 3 в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 см 3 ) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2 – 4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 см 3 ) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45 – 50 °С среду, тщательно перемешивают, затем немедленно выливают в чашку Петри и дают среде застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом. По 1 см 3 из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2 – 4 стерильные чашки Петри. Затем заливают в чашки по 15 – 20 см 3 среды, расплавленной и остуженной до 45 – 50°С, и смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат.

3. Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1 – 15 сут инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 – 50 до 100 – 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке (рис.3).

Рис. 3. Схема приготовления разведений и высева в чашки Петри

Количество клеток в 1 см 3 исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

M =

где M – количество клеток в 1 см 3 ; a – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспензии, взятый для посева, см 3 ; 10 n – коэффициент разведения.

1. Приготовить к стерилизации физиологический раствор: разлить по 9 см 3 в пробирки (по 7 пробирок на каждого студента), закрыть ватно-марлевыми пробками.

2. Подготовить чашки Петри (по 3 чашки Петри на каждого студента), пипетки (8 пипеток на 1 см 3 на каждого студента) к стерилизации.

3. Приготовить питательную среду типа ГРМ-агар для стерилизации.

4. Произвести количественный учет бактериальной культуры, предварительной выращенной на жидкой питательной среде.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

ProtoCOL 2 система для подсчёта колоний и зонного анализа

Компания Synbiosis — крупнейший в мире производитель и поставщик весьма популярных автоматических счётчиков колоний и систем для определения зон. В результате 25-летних исследований компания Synbiosis создала целый ряд специальных разработок для применения в самых широких областях. ProtoCOL 2 является номером 1 на рынке автоматических счетчиков колоний и измерителей зон.

Серия ProtoCOL 2 — новое поколение системы для подсчета колоний и измерения зон ( при определении чувствительности к антибиотикам). Она является инструментом выхода на новый уровень с уникальной возможностью и свойствами.

• Эргономичный дизайн для удобного пользования и свободного доступа.
• Сенсорный экран для быстрого входа и контроля.
• Уникальная ( патентованная ) система света для исключительного освещения всех типов чашек.
• Полностью автоматизированный учет результатов, сокращающий более чем на 80 % затраты времени, по сравнению с любым ручным методом подсчета.
• Высоко-воспроизводимые и повторяющиеся результаты.
• Отвечает наиболее высоким требованиям GLP (Надлежащая Лабораторная Практика, п.21, часть 11) и правилам QA (Обеспечение качества) .
• Имеет полный аудит и пользовательскую регистрацию разрешений.

ProtoCOL 2: Ключ к достижению успеха — гибкость (Изюминка — в гибкости)
Эргономичный дизайн ProtoCOL 2 делает применение прибора весьма комфортным и удобным.

CCD-камера высокого разрешения обеспечивает четкость изображения и детекцию колоний, диаметром 43 микрона.

Дизайн. Эргономичный дизайн экономит рабочую площадь в лаборатории и хорошо вписывается в её интерьер.

Процессор:
— Встроенный процессор устраняет необходимость во внешнем дополнительном компьютере.
— Большая встроенная память на жестком диске позволяет сохранять изображения.
— Использует операционную систему Windows XP.
— Встроенный Интернет.

Платформа. (База)
Конструкция платформы имеет взаимозаменяемые фоны (черный, белый и прозрачный) для эффективного широкопольного и тёмнопольного обзора. Могут использоваться круглые чашки, диаметром 55 — 100 мм, и квадратные чашки, размером 100 x 100 мм. По вопросу использования чашек большего диаметра просьба обращаться к консультантам компании.
Благодаря встроенному процессору, отпадает необходимость во внешнем дорогом компьютере. Жесткий диск с большой памятью позволяет сохранять изображения. Используется операционная система WINDOWS XP. Имеется подсоединение к сети Интернета.

Периферия:
— Дисковод DVD/RW позволяет сохранять и воспроизводить данные.
— Запасные USB-порты (6х) позволяют подключать клавиатуру, мышь, носители памяти.

Сенсорный экран:
— Монитор 17 » с сенсорным экраном обеспечивает легкое управление. Программное обеспечение использует большие навигационные кнопки, пользоваться которыми и наглядно и просто.
— Обзор монитора отвечает требованиям самых взыскательных пользователей.
(Если потребуется, то монитор может быть установлен для демонстрации).

Освещение:
— Уникальная световая гамма, использующая длинноволновые красные, зеленые и голубые светоизлучающие диоды ( LED ), создает прекрасное цветное изображение с 2.
— отличным контрастом.
— ProtoCOL 2 увеливает в 4 раза разрешение подобных систем.

Инновационная система освещения в ProtoCOL 2 экспонирует чашку быстрыми пучками красного, зеленого и голубого цвета. В результате этого, цветное изображение получается четким и ясным без хроматических аберраций (система защищена патентом). Автоматический процесс самокалибровки гарантирует точную цветопередачу любого участка изображения.

Программное обеспечение ProtoCOL 2
Удобство пользования

— Новое программное обеспечение ProtoCOL 2 поднимает на новый уровень контроль и функциональные возможности прибора во всех областях его применения.
— ProtoCOL 2 может быть использован как для счета колоний, так и для измерения зон, но обе программы могут быть приобретены вместе для создания многофункциональной системы.

Изображение
— Контроль системы настройки и ввода изображения в память
— Возможность импорта или экспорта изображения

Интерфейс
— Наглядная навигация с помощью большой кнопки контроля для удобства пользования

Классификация
— Пакетная система настройки и установки параметров (цвет, размер, изображение, растровая решетка)

Пароль безопасности
Различный уровень пользователей контролируется системой паролей, обспечивающей безопасность системы и гарантирующей невозможность изменения серии результатов или их ошибочное удаление. Такие особенности созданы в соответствии с требованиями контроля качества и требованиями GLP (надлежащая лабораторная практика).

Валидация
Сертификат валидации выдается каждому экземпляру ProtoCOL 2. Он гарантирует, что каждая система перед отгрузкой проверена в соответствии с требованиями стандартов сертификации. Набор документов по валидации подготовлен для контроля эксплуатационных свойств.

Аудиторский журнал.
Когда пользователи проводят настройку или вновь пересматривают полученные ранее результаты исследования в автоматическом или ручном режиме, ProtoCOL 2 автоматически создаёт копию оригинала в дополнение к новым результатам.
Пользователи могут формировать программу ProtoCOL 2 , чтобы по запросу «причина для изменения» получить свободный комментарий, записанный в поле для комментариев. Данные поддерживаются в безопасном формате, как предписывается GLP.

База данных.
Программное обеспечение построено на основе базы данных SQL таким образом, чтобы они могли быть отделены и объединены с другими системами и пакетами программ. Система отвечает всем требованиям 21 CFR, части 11.

Результаты.
Выберите таблицы с данными, методы вычисления и характер итогов. ProtoCOL 2 автоматически сохраняет все результаты с полной отслеживаемостью. Изображения могут быть сохранены в режиме полной цифровой записи каждой чашки и 3. могут быть экспортированы в Excel. Результаты могут быть связаны с модуем вычисления для статистического анализа данных исследования. Данные автоматически передаются клиенту в виде определенных шаблонов. Эти шаблоны соответствуют требованиям USP, EP и BP (Фармакопеям США, Европы и Великобритании). Данный модуль включает линейный анализ, анализ крутизны кривой, пробит-анализ, определение ED50 , 4-х параметрическуую логистическую кривую, определение предельной разовой дозы и комбинированные испытания.

ProtoCOL 2 СOUNT Подсчет колоний.
ProtoCOL 2 является комплексной системой для всех вариантов подсчета колоний.

Как только чашка вставляется в прибор, она центрируется. Проводится исследование тех партий, которые предварительно отобраны перед подсчетом. Структура партии включает тип и сследования, цвет, величина и тип сортировки. После нажатия кнопки «Измерение» активируется функция подсчета колоний, колонии быстро определяются и подсчитываются, и число колоний появляется на экране.

Возможности стандартной системы:
— определение числа цветных колоний, бляшек и величины разброса данных.
Добавляют программные модули для:
— чашек со спиральным посевом
— исследования ОФИ — опсоно-фагоцитарного индекса
— исследования БАС (бактерицидной активности сыворотки)
— теста Эймса и теста лимфомы мышей (определение мутагенной активности)
— многосекторных чашек (при изучении образцов после отбора проб воздуха) и многолуночных планшетов.

Применение

ProtoCOL 2 СOUNT является надежной системой многостороннего применения, включая исследования продуктов питания, воды, молочных продуктов, пива, гигиенические исследования, исследования в клинической микробиологии, мониторинг окружающей среды, токсикологию, испытание стерильности, исследование фармацевтических продуктов и изучение обсемененности грибами.

Подсчет колоний.
Модуль ProtoCOL 2 СOUNT позволяет подсчитывать число колоний и бляшек одним нажатием клавиши. Одновременно обнаруживаются и подсчитываются различные многочисленные окрашенные колонии. Учитываются также величина колоний и разрешающая способность прибора.
Чашки со спиральным посевом. Модуль подсчитывает колонии на чакшах со спиральным посевом, учитывая колонии на внешнем секторе верхней половины спирали посева и внешний нижний сектор спирали. Если число колоний меньше минимального объема, то модуль автоматически пересчитывает количество колоний всей чашки.
Определение опсоно-фагоцитарного индекса (ОФИ): Наиболее частой причиной пневмоний у детей и взрослых является пневмококк. Разработана антипневмококковая вакцина, т.к. эффективность антибиотиков снижена из-за распространения множественно-резистентных штаммов пневмококка. ОФА используется для определения активности антител, т .к. хорошо моделирует иммунную защиту.
Тест Эймса. Тест Эймса по определению числа обратных мутаций у бактерий используется для оценки мутагенной, и связанной с ней, карциногенной актиивностью. Генетически измененные бактерии с мутацией находятся в том же исследуемом образце. Если бактерии вырастают на среде, значит в них произошла мутация и образец, возможно, обладает мутагенной активностью.
Многосекторные чашки с пробами воздуха. Такие чашки часто используются для контроля окружающей среды, в частности воздуха. Чашки со средой помещаются в воздухозаборник, и воздух орошает только один открытый для анализа сектор. При каждом повороте подсчитывается один из секторов.

Модуль ProtoCOL 2 Zone — Измерение зон

Программа идеально подходит для измерения зон.
Каждый производитель антибиотиков должен показать, что активность конечного продукта отвечает необходимой спецификации. Одним из самых распространенных и самых трудоемких методов определения активности антибиотиков является метод, основанный на измерении зон. Ручные замеры зон — часто не воспроизводимы и не отвечают требованиям большей части известных стандартов по точности и воспроизводимости.

Модуль ProtoCOL 2 Zone — идеально подходит для следующих целей:
— определение зон ингибиции
— определение чувствительности бактерий к антибиотикам
— исследование белков методом радиальная иммуно-диффузия

Определение чувствительности к антибиотикам
Определение чувствительности к антибиотикам проводится для того, чтобы определить, является ли выделенный от человека или животных штамм бактерий чувствительным или устойчивым к действию антибиотиков, чтобы проводить эффективное лечение. Методика заключается в том, что исследуемый штамм бактерий засевается на соответствующую среду. На неё накладываются картонные диски, пропитанные различными антибиотиками или одним антибиотиком, но с разными его концентрациями. Если штамм бактерий чувствителен к антибиотику в диске, то вокруг диска образуется зона просветления (ингибиции). Чем больше зона — тем более чувствителен штамм к антибиотику.
Модуль ProtoCOL 2 Zone приспособлен для быстрого и точного измерения этих зон, не учитывая формата (размеров) диска. Результаты могут быть представлены в формате Excel и автоматически загружены в модуль вычислений и статистического анализа.

Определение зон ингибиции.
Автоматическое измерение зон ингибиции вокруг дисков или в многолуночных планшетах упрощается с применением программы ProtoCOL 2 Zone. Размер каждой зоны аккуратно измеряется и результат обсчитывается.
Метод определения зон ингибиции используются для определения активности антибиотиков и вакцин при разработке лекарств. Ручной метод определения этих зон требует от специалистов ( согласно методике ) измерения диаметров в 6 различных чашках за короткие промежетки времени, в то время как эта процедура занимает много времени. Программа ProtoCOL 2 Zone осуществляет этот процесс в течение секунды.

Радиальная иммуно-диффузия

Радиальная иммуно-диффузия — простой, но важный метод, используемый в рутинных исследованиях многих лабораторий. Метод используется для количественного определения иммуноглобуллинов, различных компонентов комплемента, а также для определения эффективности вакцин против некоторых вирусов (например, противогриппозной вакцины). C помощью программы ProtoCOL 2 Zone можно измерить зоны реакции на чашках с иммунодиффузией в определенные промежутки времени ручным методом, экспортировать эти данные для статистического анализа и сохранения изображения чашки, освобождая от многих часов монотонной работы.

Счетчики колоний

Счетчики колоний применяют в медицинской, фармацевтической, пищевой, аграрной, химической, косметической, экологической сфере для решения ряда задач:

• микробиологический анализ готовых продуктовых изделий, мяса, колбас, рыбы, молочной продукции, сыров, овощей и фруктов,
• выявление дизентерийной и брюшнотифозной палочек, трихинеллеза в свинине, вируса птичьего гриппа в мясе птицы,
• клинические исследования клеток, тканей, ДНК, выявление токсинов,
• обнаружение факторов риска на производстве пищевых изделий,
• анализ лекарств и косметики на бактериальную чувствительность к антибиотическим веществам,
• проверка фильтров и поверхностей на степень загрязненности.

Подсчет колоний показывает, сколько микроорганизмов находится в воздухе в момент контакта с питательной средой.

Исследование включает пять этапов:

• – пробоотбор и пробоподготовку,
• – разведение бактериального состава,
• – посев в чашку Петри,
• – выращивание при заданных температурных условиях,
• – учет данных.

Образец 10 раз разводится, берутся 2 последних разведения и по 0,1 мл высеиваются на среду в чаше Петри, причем каждое высеивается в 2 чаши. В качестве среды для аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов используется агар, для мицелиальных грибов и дрожжей – сусло-агар.

Концентрат растирается по емкости с помощью шпателя или стеклянных бус до полного впитывания или высыхания. Чаши закрываются, переворачиваются вверх дном и помещаются в термостат, где при температуре 36-38 градусов Цельсия выдерживаются в течение 1-4 суток – срок зависит от вида микроорганизмов. Если инкубация должна протекать в анаэробных или микроаэрофильных условиях, чашки располагают в анаэростате при поддержании требуемой газообразной атмосферы.

Выделяют несколько типов посевов.

• Равномерный. Клетки равномерно распределены по поверхности в концентрации 50, 100 или 200 мкл.
• Экспоненциальный. Плотность меняется по экспоненте, увеличиваясь к центру плоскости и уменьшаясь к краям.
• Круговой. В одной чашке производится три или шесть разведений с концентрацией во внутреннем кольце – 10мкл, в среднем – 16мкл, во внешнем – 25мкл.
• Глубинный. Однородное распределение в центре агара. Оператор сначала помещает каплю пробы на пустой поверхности, затем добавляет агаризованную среду.

Для вычисления количества жизнеспособных бактерий используется метод Коха, в соответствии с которым одна клетка порождает отдельную колонию. По величине скоплений можно сделать вывод об изначальной доле живых клеток в растворе. Данные выражают в КОЕ – количестве колониеобразующих единиц.

Если колоний немного, КОЕ определяется вручную: дно чашки делят карандашом на секторы, внутри которых точечно отмечают все образованные скопления. При большом количестве мелких колоний используются счетчики, ускоряющие процесс.

Могут присутствовать скопления следующих разновидностей:

• пигментообразующие бактерии – разноцветные, например, желтые, розовые и др., мелкие округлые – всего в 1,5-2см, могут быть прозрачными или со светящимися краями,
• бациллы – крупные, морщинистые, непрозрачные, с неровными краями,
• мукор и аспергил – пушистые,
• пенициллин – зеленого оттенка и плотные,
• актиномицеты – разноцветные, вросшие в среду.

Каждая группа выражается в процентах от суммарного КОЕ.

Проконсультируем об особенностях каждой модели, поможем выбрать нужный вам счетчик колоний, обеспечим быструю доставку, помощь в установке и эксплуатации, сервисном обслуживании.

25 приборов микробиолога

Сколько приборов должно быть в лаборатории? Я насчитала 25. Вот часть этого списка.

Автоклавы (вертикальная и горизонтальная загрузка)

АВТОКЛАВ

Автоклав – один из самых важных элементов микробиологической лаборатории. Он используется не только для стерилизации питательных сред и растворов, но и для обеззараживания посуды и отработанных материалов.

Принцип работы автоклава схож с принципом работы домашней скороварки. Максимальная температура, которую можно получить при нагреве воды, составляет 100 °C. Этого достаточно, чтоб убить бактерии, не образующие спор. Как же бороться с микроорганизмами, которые пережидают неблагоприятные условия в форме спор? Необходимо увеличить температуру. Если увеличить давление в емкости, температура пара также увеличивается. Именно это и происходит в автоклаве.

Предметы, которые необходимо стерилизовать, устанавливают в специальные корзины (чаще всего металлические). Без корзин предметы будут наполовину погружены в воду, что недопустимо.

Автоклав герметично закрывают, и начинается нагрев. Обычный цикл стерилизации составляет 15 минут при 121 °C. Время отсчитывают от момента достижения необходимых давления и температуры.

После окончания цикла стерилизации автоклав остывает, давление внутри выравнивается с атмосферным, и только после этого содержимое можно извлекать из автоклава. Системы защиты от преждевременного открывания есть даже на устаревших приборах.

СРЕДОВАРОЧНЫЕ УСТАНОВКИ

Приготовление питательных сред включает в себя несколько этапов: растворение, нагрев, стерилизация, разлив. Все они могут осуществляться в одном приборе (средоварочной установке) и без участия оператора.

Морозильная камера лабораторная

ХОЛОДИЛЬНИКИ И МОРОЗИЛЬНЫЕ КАМЕРЫ

Холодильник и морозильная камера служат для хранения чувствительных к температуре веществ, растворов, антибиотиков, сывороток и биохимических реактивов. Также некоторые стоковые культуры микроорганизмов могут храниться в холодильнике между посевами.

Кроме того, в холодильнике хранят готовые стерильные питательные среды, что позволяет уберечь их от высыхания.

Хранить питательные среды и стоковые культуры в одном холодильнике запрещено.

БОКС БИОБЕЗОПАСНОСТИ

Бокс биобезопасности используется для асептического перенесения стерилизованных материалов, а также для посева микроорганизмов. Частицы пыли в воздухе и аэрозоли содержат микроорганизмы, которые могут попасть в образец или стерильные среды и загрязнить их. Чтоб этого избежать при посеве, его проводят в стерильной зоне вокруг пламени горелки Бунзена или в специальном боксе биобезопасности. В бокс подается воздух, который прошел через HEPA-фильтр (High Efficiency Particulate Air filter – высокоэффективный фильтр для воздуха, насыщенного частицами). Поток воздуха направлен вперед, за счет чего воздух извне попасть в бокс не может. Таким образом внутри бокса достигается стерильность.

В зависимости от класса опасности микроорганизмов используют боксы биобезопасности 2 или 3 класса.

ИК-СТЕРИЛИЗАТОР БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПЕТЕЛЬ

Инфракрасный стерилизатор петель удобен для использования в ламинарном боксе, поскольку под ламинарным потоком пламя горелки отклоняется, а ИК-стерилизатор открытого огня не имеет.

ИНКУБАТОР

Обильный рост микроорганизмов достигается выращиванием их в лабораторных условиях при благоприятной температуре. Микроорганизмы сеют на подходящие питательные среды и помещают в инкубатор с заданной температурой. Большинство микроорганизмов, патогенных для человека, растут при нормальной температуре тела человека – 37 °C.

В инкубаторе есть термостат, который поддерживает заданную температуру, однако значения приблизительны. Чтоб получить точную температуру, необходимо поместить внутрь инкубатора термометр. Современные инкубаторы самостоятельно регулируют нагревание согласно запрограммированному значению. Таким образом, оператор освобождается от необходимости согласовывать температуру, указанную на термостате, с температурой, которая фактически достигается в инкубаторе.

СЧЕТЧИК КОЛОНИЙ

При подсчете микроорганизмов считается, что из одной клетки в образце образуется одна колония на плотной питательной среде. Таким образом, подсчитав количество колоний, можно оценить количество микроорганизмов в исходном образце.

Иногда колонии маленькие и плотно прилегают друг к другу. В таком случае подсчет вручную затруднен. Значительно проще оценивать результаты, используя счетчики колоний. Условно можно выделить 3 типа счетчиков:

Счетчик колоний с увеличительным стеклом

Увеличительное стекло облегчает подсчет колоний, а маркер оставляет след на чашке и автоматически считает количество отметок. Результат подсчета фиксирует цифровой счетчик на панели прибора.

Счетчик колоний в форме ручки Fisherbrand

Маркер оставляет след на чашке и автоматически считает количество отметок. Результат подсчета фиксирует цифровой счетчик на ручке.

Чашка устанавливается под объектив камеры в корпусе прибора. Полученный снимок анализирует программное обеспечение и выдает результат на монитор компьютера.

МИКРОСКОП

Микроскоп используется для исследования морфологии, подвижности, а также биохимических и флуоресцентных характеристик.

АВТОМАТИЧЕСКИЕ АНАЛИЗАТОРЫ

Приборы определяют количество микроорганизмов или идентифицируют видовую принадлежность разными методами (мечение антителами, анализ биохимических характеристик, изменение электрофизических или оптических свойств среды и т.д.). Приборы используют для сокращения времени получения результатов, увеличения точности и снижения доли ручного труда.

СУХОВОЗДУШНЫЙ СТЕРИЛИЗАТОР

Используется для стерилизации стеклянных изделий, например, пипеток, пробирок, чашек Петри. Жидкости, например, питательные среды и разбавители, суховоздушной стерилизации не подвергаются, поскольку они могут терять воду вследствие испарения.

Стеклянные изделия стерилизуют при 180 °C в течение 3 часов.

Стерилизатор старого образца

В старых моделях стерилизаторов температура контролировалась переключателем, и для установки нужной температуры приходилось подбирать нужное положение терморегулятора методом проб и ошибок. Температура при этом определялась термометром, который помещался внутрь прибора.

В современных стерилизаторах цифровой дисплей и автоматический регулятор температуры позволяют с легкостью установить нужную температуру.

Время стерилизации определяет цифровой таймер. После загрузки дверь закрывается, и стерилизатор включается. После прохождения необходимого времени стерилизации прибор автоматически выключается, но открыть дверцу можно только после того, как температура внутри стерилизатора достигнет комнатной, иначе стеклянные изделия могут треснуть.

ДЕЗИНФЕКЦИОННО-МОЕЧНАЯ МАШИНА

Хорошо вымытая посуда – это залог достоверных результатов анализа. Многие лаборатории предпочитают мыть посуду вручную, используя при этом тонны воды. Сэкономить воду и труд работников помогут дезинфекционно-моечные машины, похожие на бытовые посудомоечные машины, но со специальными режимами стерилизации и штативами для лабораторной посуды.

В следующем материале расскажу о других необходимых в лаборатории приборах. У Вас есть что добавить? Пишите в комментариях!

Подписывайтесь на наши обновления и получайте полезные советы и материалы первыми!

Колониеобразующая единица

В микробиологии , А колониеобразующих единиц / колониеобразующих единицы ( КОЕ ) является единицей , используемой для оценки количества жизнеспособных бактерий или грибковых клеток в образце. Устойчивость определяется как способность к размножению через от бинарного деления в контролируемых условиях. Подсчет с помощью колониеобразующих единиц требует культивирования микроорганизмов и подсчета только жизнеспособных клеток, в отличие от других анализов, таких как эпифлуоресцентная микроскопия или проточная цитометрия, которая подсчитывает все клетки, живые или мертвые. Внешний вид колонии в культуре клеток требует значительного роста, и при подсчете колоний нельзя быть уверенным, что колония произошла от одной клетки (это может быть группа клеток). Выражение результатов в виде колониеобразующих единиц отражает эту неопределенность.

Резюме

• 1 Теория

Теория

Целью подсчета на агаре является оценка количества присутствующих клеток в соответствии с их способностью давать рост колонии при определенных условиях питательной среды, температуры и времени. Теоретически жизнеспособная клетка может дать начало колонии путем репликации. Однако одиночные клетки являются исключением по своей природе, и колония может происходить из массы клеток, отложенных вместе или физически близко друг к другу. Кроме того, многие бактерии растут цепочками (например, Streptococcus ) или группами (например, Staphylococcus ). Оценка количества клеток путем подсчета КОЕ в большинстве случаев занижает количество живых клеток, присутствующих в образце по этим причинам. Действительно, подсчет КОЕ предполагает, что каждая колония разделена и основана на одной жизнеспособной микробной клетке.

Для E. coli счет является линейным в диапазоне от 30 до 300 КОЕ на чашке Петри стандартного размера. Следовательно, чтобы гарантировать, что образец будет производить КОЕ в этом диапазоне, образец должен быть разбавлен и несколько разведений распределены по нескольким чашкам. Обычно используются разведения 1/10, а серия разведений распределяется на 2 или 3 повтора в выбранном диапазоне разведений. UFC / планшет считывается с планшета в линейном диапазоне, затем UFC / г (или КОЕ / мл) оригинала вычисляется математически с учетом количества планшета и его коэффициента разбавления.

Преимущество этого метода состоит в том, что разные виды микробов могут давать рост колоний, которые явно отличаются друг от друга как микроскопически, так и макроскопически. Морфология колоний может оказать большую помощь в идентификации присутствующих микроорганизмов [исх. необходимо] .

Предварительное понимание микроскопической анатомии организма может обеспечить лучшее понимание того, как наблюдаемые КОЕ / мл соотносятся с количеством жизнеспособных клеток на миллилитр. В качестве альтернативы в некоторых случаях можно уменьшить среднее количество клеток на КОЕ, взбалтывая образец перед выполнением разведения. Однако многие микроорганизмы являются хрупкими, и в них будет уменьшаться доля жизнеспособных клеток, помещенных в вихрь.

Логарифмическая запись

Концентрации колониеобразующих единиц могут быть выражены с использованием логарифмической записи, где указанное значение является логарифмом с точностью до 10 от концентрации. Это позволяет рассчитать логарифмическое сокращение процесса дезактивации как простое вычитание.

Использует

Колониеобразующие единицы используются в микробиологии для количественной оценки результатов многих методов подсчета и посева на агар, включая:

• Метод литых пластин, при котором образец суспендируют в чашке Петри с использованием расплавленного агара, охлажденного примерно до 40-45 ° C (чуть выше точки затвердевания, чтобы минимизировать гибель клеток, вызванную нагреванием). После затвердевания питательного агара планшет инкубируют.
• Метод рассредоточенной чашки, при котором образец (в небольшом объеме) распределяют по поверхности чашки с питательным агаром и дают высохнуть перед инкубацией для подсчета.
• Метод мембранной фильтрации, при котором образец фильтруется через мембранный фильтр, а затем фильтр помещается на поверхность чашки с питательным агаром (бактериями вверх). Во время инкубации питательные вещества проходят через фильтр для питания растущих клеток. Поскольку площадь большинства фильтров меньше, чем у стандартной чашки Петри, линейный диапазон счета будет меньше.
• Методы Майлза и Мисры (или метод осаждения на чашки), при которых очень небольшая аликвота (обычно около 10 микролитров) образца из каждого серийного разведения помещается в чашку Петри. Анализировать агар следует, пока колонии очень малы, чтобы избежать потери КОЕ по мере роста.

Однако с методами, которые требуют использования чашки с агаром, нельзя использовать жидкий раствор, потому что невозможно определить чистоту образца и невозможно подсчитать клетки в жидкости по одной.

Инструменты для подсчета колоний

Подсчет колоний традиционно проводится вручную с помощью ручки и счетчика щелчков. Обычно это простая задача, но она может стать очень трудоемкой и отнимать много времени, когда нужно подсчитать много бляшек. В качестве альтернативы можно использовать полуавтоматические (программные) и автоматические (аппаратные + программные) решения.

Программное обеспечение для подсчета КОЕ

Колонии можно подсчитать по изображениям чашек, проанализированных программным обеспечением. Экспериментаторы обычно фотографируют каждую тарелку, которую им нужно посчитать, а затем анализируют все изображения (это можно сделать с помощью простой цифровой камеры или даже веб-камеры). Поскольку для создания одной фотографии требуется менее 10 секунд, а не несколько минут для подсчета PDU вручную, такой подход обычно позволяет значительно сэкономить время. Кроме того, он более объективен и позволяет извлекать другие переменные, такие как размер и цвет колоний.

Вот три примера:

• OpenCFU — это бесплатная программа с открытым исходным кодом, предназначенная для оптимизации простоты использования, скорости и надежности. Он предлагает широкий спектр фильтров и элементов управления, а также современный пользовательский интерфейс. OpenCFU написан на C ++ и использует OpenCV для анализа изображений.
• NICE — это программа, написанная на MATLAB, которая позволяет легко подсчитывать колонии по изображениям.
• ImageJ и CellProfiler: для подсчета колоний можно использовать некоторые макросы и плагины ImageJ, а также некоторые конвейеры CellProfiler. Это часто требует от пользователя изменения кода для достижения эффективного рабочего процесса, но может быть полезным и гибким. Основной проблемой является отсутствиеспециального графического интерфейса, который может затруднить взаимодействие с алгоритмами обработки.

Помимо программного обеспечения на базе традиционных настольных компьютеров, доступны приложения для устройств Android и iOS для полуавтоматического и автоматического подсчета колоний. Встроенная камера используется для фотографирования чашки с агаром, а внутренний или внешний алгоритм используется для обработки данных изображения и оценки количества колоний.

Автоматизированные системы

Многие автоматизированные системы используются для противодействия человеческой ошибке, поскольку многие методы исследования, выполняемые людьми для подсчета отдельных клеток, сопряжены с высоким риском ошибки. Поскольку исследователи регулярно вручную подсчитывают количество клеток с использованием проходящего света, этот подверженный ошибкам метод может существенно повлиять на расчетную концентрацию в основной жидкой среде, когда клетки маленькие.

Полностью автоматизированные системы также доступны от некоторых производителей биотехнологии. Как правило, они дороги и не так гибки, как автономное программное обеспечение, поскольку оборудование и программное обеспечение предназначены для совместной работы для конкретной конфигурации [исх. необходимо] . В качестве альтернативы некоторые автоматические системы используют парадигму спирального шпона.

Некоторые автоматизированные системы, такие как системы MATLAB, позволяют подсчитывать клетки без необходимости их окрашивания. Это позволяет повторно использовать колонии для дальнейших экспериментов без риска уничтожения окрашенных микроорганизмов. Однако недостатком этих автоматизированных систем является то, что чрезвычайно трудно различать микроорганизмы по пыли или царапинам на пластинах с кровяным агаром, поскольку пыль и царапины могут создавать очень разнообразную комбинацию форм и размеров.

Альтернативные единицы

Вместо колониеобразующих единиц можно использовать параметры наиболее вероятного числа (MPN) и модифицированных единиц Фишмана (MFU). Метод наиболее вероятного числа позволяет подсчитывать жизнеспособные клетки и полезен при подсчете низких концентраций клеток или подсчете микробов в продуктах, где частицы делают подсчет на планшете нецелесообразным. В модифицированных установках Fishman учитываются жизнеспособные, но не культивируемые бактерии.